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論文(リポジトリ) |
論文(リポジトリ)
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柴崎, 康彦
概要:
【背景】近年さまざまな幹細胞において,増殖・自己複製に特徴的な場があることが明らかにされつつあり,その特徴的な場はニッチと呼ばれている.マウスの造血幹細胞ではニッチとして骨芽細胞や血管内皮細胞が注目を浴びており,いくつかの接着因子やケモカイ
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ンの関与についての報告がなされている.しかしながらヒトにおいては造血幹細胞ニッチについての詳細な検討はなされていない.そこで今回我々はヒト骨髄細胞由来間葉系幹細胞及び骨芽細胞による骨髄由来ヒトCD34陽性造血前駆細胞の増幅効果について検討した.【方法と結果】正常ヒト骨髄より骨髄単核球を分離し専用のmediumを用いて間葉系幹細胞及び骨芽細胞を培養した.また正常ヒト骨髄由来単核球よりCD34陽性細胞を分離し間葉系幹細胞及び骨芽細胞との共培養を7日間行った.さらに,PETメンブレンインサートを用いて非接触系の培養を行い接着因子の関与についても検討した.間葉系幹細胞との共培養では,Feeder freeのコントロール群に比べ有意にCD34陽性細胞の増殖が認められた.一方,骨芽細胞との共培養においても,コントロール群に比べ有意にCD34陽性細胞の増殖が認められた.間葉系幹細胞と骨芽細胞との共培養においてはCD34陽性細胞の増殖に有意な差は認められなかった.一方でCD34陽性細胞率については,間葉系幹細胞との共培養,骨芽細胞との共培養のいずれにおいてもfeeder freeのコントロールと比べて有意差を認めなかった.非接触系においては接触系の培養に比べ間葉系幹細胞及び骨芽細胞との共培養による増殖効率が低下した.しかしfeeder freeのコントロールに比べ特に骨芽細胞との共培養においてCD34陽性細胞の増殖を認めた.【結語】間葉系幹細胞,骨芽細胞との共培養において,共にCD34陽性造血前駆細胞の増殖を促進することが確認された.このことは間葉系幹細胞,骨芽細胞による造血前駆細胞の増殖において正の制御機構が存在することが示唆された.また非接触系においてもコントロールと比べ増殖が促進されたことからCD34陽性造血前駆細胞の増殖には接着因子からのシグナルと共に間葉系幹細胞や骨芽細胞が産生するケモカインなどの液性因子が関与している可能性が考えられた.
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学位論文(リポジトリ) |
学位
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中山, 明美
概要:
In part 1, we analyzed the recovery feature of murine hematopoietic stem cells (HSCs) in hematopoietic reconstitution, a
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nd tried to expand of HSCs in vitro. Mice which were transplanted bone marrow cells of syngenic mice after lethal irradiation, were analyzed the recovery of HSCs (Lineage maker negative, Sca-1 positive, c-kit positive cells, KSL cells) in bone marrow or spleen by flowcytometer. Flow-cytometric analysis revealed that KSL cells proliferated from day 3 after transplantation. This result suggested the existence of systems that could expand HSCs effectively in hematopoietic tissues after bone marrow transplantation. Because we expected that serum obtained from mice transplanted after day 3 (day 3 serum) include factors for expansion of hematopoietic stem cells, whole bone marrow cells were co-cultured with hematopoietic supportive cell line. Day 3 serum could expand HSCs among whole bone marrow cells approximately 25 times; however, HSCs were not expanded with normal mouse serum. These results indicated that there were effective factors in day 3 serum for expansion of HSCs, not in normal serum. Although whole bone marrow cells were co-cultured in day 3 serum, HSCs were not expanded when direct contact between the whole bone marrow cells and supportive cell line was prevented. This result revealed that direct contact between the whole bone marrow cells and hematopoietic supportive cells was essential for proliferation of HSCs. Gene expression of cytokines that were reported the relationship to proliferation of HSCs was up-regulated in hematopoietic supportive cell line that HSCs were expanded, compared to normal. In other words, factors included in day 3 serum lead gene expression of these cytokines. The level of testosterone in the day 3 serum was significantly higher than normal serum, measured by ELISA. The addition of testosterone in the co-culture with hematopoietic supportive cells expanded the HSCs among whole bone marrow cells. Furthermore, hematopoietic supportive cells stimulated by testosterone was also up-regulated the expression of some cytokines, as well as co-cultured in day 3 serum. These date suggest that the one of these factors for expansion of HSCs in day 3 serum is testosterone. In spite of whole bone marrow cells were cultured with day 3 serum, HSCs were not expanded without hematopoietic supportive cells. Thus, we expected that these factors in day 3 serum would influence to hematopoietic supportive cells, and produced when bone marrow cells were contacted. To clone these factors exhaustively, cDNA subtraction method was planed.<br />In part 2, we reported the cloning of genes that were significantly expressed in bone marrow 3 days after transplantation, by cDNA subtraction. We found that the expression of 237 genes were significantly higher in transplanted bone marrow cells than in normal bone marrow cells by screening about 2000 clones. Twenty clones (about 1%, 4 clones are duplicate) are functionally unknown. Other clones were emzyme related genes (about 15%), mitochondria related genes (about 15%), Immunogloblin related genes (about 15%), transport and secretion related genes (about 15%), cytoskeleton related genes (about 10%), cytokine and chemokine genes (about 5%), ribosomal genes (5%). We analyzed the expression of 8 clones, which including 2 function-unknown genes. First, we analyzed gene expression quantitatively in bone marrow after bone marrow transplantation by Real-time PCR. It revealed that the expression of all 8 genes increased from day 1 to day 3 after transplantation, then decreased gradually at steady state till day 18. These gene expressions were prior to the recovery feature of HSCs after bone marrow transplantation. It suggested strongly that these genes were involved in recovery of HSCs. By the way, it is not cleary understood about the regulation systems of expansion for HSCs in early embryogenesis. It was thought that regulation system of expansion for HSCs in early embryogenesis was common to in bone marrow transplantated mouse. Whole mount in situ hybridization analysis had revealed that 4 genes amoung 8 genes were specifically expressed in aorta-gonad-mesonephros (AGM) region of murine embryo on 10.5 days (E10.5), which site is thought to expand HSCs in embryo. These results indicate that regulation systems of expansion of HSCs in bone marrow transplantation and in embryogenesis are alike.<br />まずpart 1では,造血系再構築時の造血幹細胞の回復動態を解析し,in vitroにおける造血幹細胞増殖を試みた。マウスに致死量放射線照射後,同系マウスの骨髄細胞を移植し,継時的に骨髄,あるいは脾臓中の造血幹細胞分画であるKSL細胞(分化抗原陰性,Sca-1陽性,c-kit陽性細胞)の回復動態をフローサイトメーターで解析したところ,移植後3日目から造血幹細胞(KSL細胞)が著しく増加していた。この結果は,骨髄移植後3日目の造血組織では造血幹細胞を効率良く増殖させるシステムが存在することを示唆していた。そこで,骨髄移植後3日目のマウス血清中に造血幹細胞増殖因子の存在を想定し,全骨髄細胞と造血支持骨髄細胞株との共培養を試みたところ,この移植後3日目のマウス血清を用いることによって,全骨髄細胞中の造血幹細胞を培養開始時の約25倍にまで増加させることができた。これに対し,正常マウス血清には造血幹細胞増殖効果は認められなかった。つまり,骨髄移植後3日目の血清中に,正常血清中には存在しない,造血幹細胞増殖に有効な因子が含まれていることが明らかとなった。ところが,移植後3日目の血清を用いても,全骨髄細胞と造血支持細胞株が接触できない培養条件下では,造血幹細胞は増殖できなかった。このことは,造血幹細胞の増殖には造血支持細胞との直接接触も重要であることを示す。ところで,造血幹細胞が増殖した造血支持細胞株においては,造血幹細胞増殖に関与することが報告されている複数のサイトカインの発現が,共培養前の造血支持細胞株に比べ上昇していた。つまり,骨髄移植後3日目の血清中に含まれる因子は,造血支持細胞にこれらのサイトカインの発現を誘導したのである。マウス血清中のテストステロン濃度をELISA法により測定すると,骨髄移植後3日目のマウス血清中で正常マウス血清に比べ有意に上昇しており,造血支持細胞株と全骨髄細胞の共培養系にテストステロンを添加すると,造血幹細胞の増殖を認めた。また,テストステロン刺激造血支持細胞株において,移植後3日目の血清を用いた時と同様なサイトカインの発現上昇を認めた。従って,骨髄移植後3日目のマウス血清中に含まれる造血幹細胞増殖に関わる因子の一つは,テストステロンであると考えられる。らに,骨髄移植後3日目の血清単独では,造血幹細胞増殖は誘導できなかったので,血清中の因子が支持細胞に作用し,支持細胞が骨髄細胞と接触しているときに,造血幹細胞増殖に関わる因子が産生されるものと考えられた。そこで,in vivoにおけるこれらの因子を網羅的にクローニングすることを目的として,cDNAサブトラクションによる遺伝子タローニングを計画した。<br />次にPart 2では,このcDNAサブトラクションにより骨髄移植後3日目の骨髄で顕著に発現の上昇している遺伝子をクローニングした結果を報告する。cDNAサブトラクションの結果,骨髄移植後3日目の骨髄で特異的に発現している遺伝子2000クローンをまず特定し,二次スクリーニングにより骨髄移植後3日目の骨髄で顕著に発現の高い遺伝子237クローンを絞り込んだ。このうち20クローン(およそ10%,4クローンは重複)は機能未知遺伝子だった。その他のクローンの構成は,酵素関連遺伝子;15%,ミトコンドリア関連遺伝子;15%,Immunogloglin関連遺伝子;15%,輸送・分泌関連遺伝子;15%,細胞骨格関連遺伝子;10%,サイトカイン・ケモカイン遺伝子;5%,リボソーム遺伝子;5%であった。この中から,機能未知遺伝子2クローンを含む8クローンを選びさらに詳細な発現解析を行った。まず,骨髄移植前後の骨髄での遺伝子発現をReal-time PCRにより定量的に解析したところ,すべてのクローンは,移植後1日目から3日目にかけて顕著な発現増加を認め,移植後18日目には正常値と同程度まで戻った。この発現の様式は骨髄移植マウスにおける造血幹細胞数の回復動態に先行しており,これらの遺伝子産物が造血幹細胞の回復に関与することを強く示唆するものであった。ところで,発生初期における造血幹細胞の増殖がどのような制御下に行われているかはまだ完全に明らかになっていない。発生初期における造血幹細胞の増幅システムは,骨髄移植時に認められる造血幹細胞の増幅システムと共通する部分がある可能性が考えられた。そこで,whole mount in situ hybridizationを行い,胎生期の造血幹細胞の増幅が行われるとされる胎生10.5日目胚のAGM(aorta-gonad-mesonephros)領域におけるこれらの遺伝子の発現を解析したところ,8クローン中4クローンの発現が顕著に上昇している事を認めた。これらの知見は,骨髄移植時における造血幹細胞の増殖システムと,胎生期における造血幹細胞の増殖システムが類似していることを示唆するものと考えられる。<br />新大院博（理）甲第250号
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