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1.

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鈴木, 亮 ; 新村, 末雄
Published: 新潟大学農学部研究報告 = 新潟大学農学部研究報告.  64  pp.1-6,  2011-09.  新潟大学農学部
Full Text Link: http://hdl.handle.net/10191/18619
Abstract: 胞状卵胞から採取して培養したブタ卵丘・卵母細胞複合体(COC)について、卵丘細胞と卵母細胞のグルコース-6- リン酸脱水素酵素(G6PDH)活性および卵母細胞の核成熟の変化を観察し、G6PDH 活性と卵母細胞の核成熟との間にどのような関係が あるのかを検討した。COC の卵母細胞において、強度のG6PDH 活性を示すものの割合は、培養後0、8および22時間では75.0ないし89.3%と高かったが、それ以降低下し、培養後32および44時間ではそれぞれ36.2および18.3%となった。また、G6PDH 活性の低下に伴って卵母細胞の核成熟は進行し、培養後32および44時間では、核は第一成熟分裂中期から第二成熟分裂中期にあった。G6PDH 活性の阻害剤であるDHEA を含む培養液で22時間培養したCOC において、卵母細胞の成熟分裂の再開はほとんどで抑制されているとともに、卵丘細胞と卵母細胞の両者でG6PDH 活性も明らかに抑制されていた。また、DHEA とともにコレステロールあるいはプロゲステロンを含む培養液で22時間培養したCOC の卵母細胞において、成熟分裂を再開したものの割合は、それぞれ70.0および60.0%であり、DHEA のみで処置した対照のものの18.3および20.4%に比べて有意に高かった。以上の結果から、COC におけるG6PDH 活性と卵母細胞の核成熟との間には密接な関係があり、卵母細胞の核成熟には、卵丘細胞のG6PDH 活性によって産生されるNADPH が産生を促すコレステロールとプロゲステロンが成熟誘起物質として役割を果たしていることが示唆された。 Read more
2.

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Takano, Hiroko ; Niimura, Sueo
Published: 新潟大学農学部研究報告 = 新潟大学農学部研究報告.  61  pp.27-33,  2008-09.  新潟大学農学部
Full Text Link: http://hdl.handle.net/10191/13064
Abstract: We previously reported in porcine oocytes that the activities of some hydroxysteroid dehydrogenases (HSDs) and the size of lipid droplets in the cytoplasm decreased as nuclear maturation progressed, and that the progression of nuclear maturation, the decrease of HSD activities and the reduction in the size of lipid droplets did not occur in those treated with olomoucine. From these results, we suggested that the changes in the steroid metabolism and the size of lipid droplets in the cytoplasm were closely associated with nuclear maturation. However, whether olomoucine directly acts on the cytoplasm to inhibit such changes could not be determined. In the present investigation, the activities of some HSDs and Sudanophilic lipid droplets were histochemically demonstrated in porcine oocytes in which the nuclear maturation was suppressed and the high cAMP level in the cytoplasm was maintained by the treatment of IBMX or dbcAMP, in order to clarify the relationship between nuclear maturation and the metabolism of steroids and the number of lipid droplets in the cytoplasm. Of the oocytes cultured with IBMX or dbcAMP for 22 hrs, 97 and 100% were in the germinal vesicle (GV) stage, respectively. The percentages of oocytes in the GV stage were significantly higher in both the treated oocytes than in control oocytes. The rates of the treated oocytes showing the activities of Δ^<5>-3β-HSD (using pregnenolone and 17α-hydroxypregnenolone as the substrates), 17β-HSD (estradiol-17β), 20α-HSD (20α-hydroxyprogesterone) and 20β-HSD (17β-hydroxyprogesterone) did not differ from those of control oocytes. Also, there were no differences in the number of lipid droplets of different sizes between IBMX- or dbcAMP-treated oocytes and control oocytes. From these findings, it was suggested that the changes in the steroid metabolism and the size of lipid droplets in the cytoplasm with oocyte maturation depend on the cAMP level in their cytoplasm rather than the progression of nuclear maturation.<br />我々は、ブタ卵母細胞において、核の成熟に伴って細胞質ではいくつかのステロイドの代謝低下と脂質小滴の小型化が起こることを以前報告した。また、核の成熟をオロモウシンで処置して阻止した卵母細胞では、ステロイド代謝の低下および脂質小滴の小型化はみられなかったことから、細胞質でのこれらの変化は核の成熟と密接に関係していることを推察して報告した。しかし、オロモウシンがステロイド代謝の低下および脂質小滴の小型化に直接関係しているのか否かは明らかにできなかった。そこで、オロモウシンとは異なった機構、すなわち細胞質のcAMPレベルを高く維持することによって核の成熟を抑制する作用のあるIBMXとdbcAMPを用いて、ブタの卵母細胞を処置し、ステロイド代謝と脂質小滴の数を組織化学的に観察した。IBMXあるいはdbcAMPで22時間処置した卵母細胞において、核は97および100%で卵核胞期にあり、これらの処置により成熟分裂の再開が抑制されていることが確認された。一方、IBMX あるいはdbcAMPで22時間処置した卵母細胞において、Δ^<5>-3β-HSD活性(基質としてpregnenoloneと17α-hydroxypregnenolone を使用)、17β-HSD 活性(estradiol-17β)、20α-HSD 活性(20α-hydroxyprogesterone)および20β-HSD活性(17β-hydroxyprogesterone)を有するものの割合、ならびに各種大きさの脂質小滴の数は、どちらも対照の卵母細胞におけるそれらと相違なかった。以上の結果から、細胞質におけるステロイド代謝の低下および脂質小滴の小型化は、核の成熟の進行よりも、細胞質のcAMP の量に依存して起こることが推察された。 Read more
3.

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Takano, Hiroko ; Niimura, Sueo
Published: 新潟大学農学部研究報告 = 新潟大学農学部研究報告.  60  pp.123-128,  2008-03.  新潟大学農学部
Full Text Link: http://hdl.handle.net/10191/6422
Abstract: We formerly reported in porcine oocytes that cortical granules (CGs) move to the cytoplasm immediately beneath the plasm a membrane as nuclear maturation progresses, and that the movement of CGs and the resumption of meiotic division do not occur in those treated with olomoucine. Therefore, we suggested that CGs distribution in the cytoplasm is closely associated with nuclear maturation. However, whether olomoucine directly acts on the cytoplasm to inhibit such change in CGs distribution could not be determined. In the present investigation, the distribution of CGs was lectin-histochemically observed in porcine oocytes treated with IBMX or dbcAMP, which suppresses the nuclear maturation with the mechanism different from olomoucine, and also in porcine oocytes treated with olomoucine and dbcAMP, in order to examine the relationship between nuclear maturation and the distribution of CGs in the cytoplasm. Nuclei of the oocytes cultured for 22 hrs with IBMX, dbcAMP, or olomoucine and dbcAMP were all in the germinal vesicle (GV) stage. The percentages of oocytes in the GV stage were significantly higher in the treated oocytes than in control oocytes. CGs in the oocytes treated with IBMX, dbcAMP, or olomoucine and dbcAMP were distributed in the cortical cytoplasm and also immediately beneath the plasma membrane. The distribution of CGs in such the treated oocytes did not differ from those of control oocytes. From these results, it was suggested that the changes in the distribution of CGs in the cytoplasm with oocyte maturation depend on the cAMP level in their cytoplasm rather than the progression of nuclear maturation.以前我々は、ブタ卵母細胞において、表層粒は核の成熟に伴って細胞膜直下の細胞質に移動するとともに、核の成熟をオロモウシンで処置して阻止した卵母細胞ではこのような表層粒の分布変化はみられなかったことから、表層粒の分布変化と核の成熟とは密接に関係していることを推察して報告した。しかし、オロモウシンが表層粒の分布変化に直接関係しているのか否かは明らかにできなかった。そこで、オロモウシンとは異なった機構、すなわち細胞質のcAMPレベルを高く維持することによって核の成熟を抑制する作用のあるIBMXとdbcAMPを用いて、ブタの卵母細胞を処置し、表層粒の分布変化をレクチン組織化学的に観察した。IBMX、dbcAMPあるいはオロモウシンとdbcAMPで22時間処置した卵母細胞において、核はすべてが卵核胞期にあり、これらの処置により成熟分裂が抑制されていることが確認された。一方、IBMX、dbcAMPあるいはオロモウシンとdbcAMPで22時間処置した卵母細胞において、表層粒は、細胞質の表層および細胞膜直下の細胞質に分布しており、対照の卵母細胞における分布と相違なかった。以上の結果から、細胞質における表層粒の分布は、核の成熟の進行よりも、細胞質のcAMPの量に依存して変化することが推察された。 Read more
4.

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Kitagawa, Tokihisa ; Niimura, Sueo
Published: 新潟大学農学部研究報告 = 新潟大学農学部研究報告.  59  pp.21-26,  2006-08.  新潟大学農学部
Full Text Link: http://hdl.handle.net/10191/670
Abstract: The size of each part of porcine oocytes cultured in NCSU37 medium, NCSU37 medium whose NaCl concentration was lowered f rom 108.76 to 61.6 mM and NCSU37 medium containing 0.1% tunicamycin, an inhibitor of glycoprotein synthesis, was measured to investigate how the size of the perivitelline space changed as oocytes matured, and the reason(s) the size of the perivitelline space changed. The incidence of polyspermy in porcine oocytes after insemination was also observed, in order to ascertain a relationship between the size of the perivitelline space and the incidence of polyspermy. The size of perivitelline space enlarged as the time of culture was prolonged, even in the use of either medium examined. The perivitelline space in oocytes cultured in NCSU37 medium for 44 hrs was 3.9μm, but it was a significantly larger in oocytes cultured in NCSU37 medium with decreased concentration of NaCl (6.4μm) and a significantly smaller in oocytes cultured in NCSU37 medium containing tunicamycin (2.4μm). From the measurements of each part of oocytes during culture, it was suggested that the enlargement in the perivitelline space following treatment with low NaCl was attributed to reduction of the oocyte cytoplasm, while the decrease in the perivitelline space following treatment with tunicamycin was attributed to expansion of the oocyte cytoplasm. Oocytes cultured for 44 hrs in NCSU37 medium, NCSU37 medium with decreased concentration of NaCl and NCSU37 medium containing tunicamycin showed the maturation rate of 88.8, 93.7 and 87.2%, respectively, and the fertilization rate after insemination of 83.6, 87.0 and 88.2%, respectively. There were no differences in either the maturation rate or the fertilization rate seen among these three culture media. On the other hand, the incidence of polyspermy of oocytes matured in NCSU37 medium was 52.1%, which was significantly higher than 30.0% of oocytes matured in NCSU37 medium with decreased concentration of NaCl, and was significantly lower than 71.7% of oocytes matured in NCSU37 medium containing tunicamycin. From these findings, it was clarified that the higher incidence of polyspermy is closely related to the smaller perivitelline space in porcine oocytes.<br />NaClの濃度を低くした低NaCl-NCSU37培養液およびツニカマイシン添加NCSU37培養液で培養したブタの卵丘卵母細胞複合体について、卵母細胞の各部位の大きさを計測して通常のNCSU37培養液で培養した卵母細胞のものと比較し、低NaCl処置およびツニカマイシン処置した卵母細胞の囲卵腔の大きさが変化する原因について検討した。また、媒精後の多精子侵入の頻度を観察し、ブタ卵母細胞の囲卵腔の大きさと多精子侵入の頻度との間に関係があるのか否かを検討した。囲卵腔は、いずれの種類の培養液で培養した卵母細胞においても、成熟に伴って拡大した。なお培養後44時間において、囲卵腔は、通常のNCSU37培養液で成熟させた卵母細胞では3.9μmあったが、低NaCl-NCSU37培養液で成熟させた卵母細胞では有意に拡大して6.4μmになるとともに、ツニカマイシン添加NCSU37培養液で成熟させた卵母細胞では有意に縮小して2.4μmになった。一方、卵母細胞の各部位の計測から、低NaCl-NCSU37培養液で培養した卵母細胞で囲卵腔が大きくなったのは、卵母細胞の細胞質が収縮したことによるものと思われた。また、ツニカマイシン添加NCSU37培養液で培養した卵母細胞の囲卵腔が小さくなったのは、卵母細胞の細胞質が拡大したことによるものと思われた。一方、NCSU37培養液、低NaCl-NCSU37培養液およびツニカマイシン添加NCSU37培養液で44時間培養した卵母細胞の成熟率および媒精後の受精率は、それぞれ88.8、93.7、87.2%および83.6、87.0、88.2%であり、これら3種の培養液の間で成熟率と受精率に相違はみられなかった。また多精子侵入の頻度は、NCSU37培養液で成熟させた卵母細胞では52.1%であったが、低NaCl-NCSU37培養液で成熟させて囲卵腔が大きくなった卵母細胞では有意に低く30.0%であるとともに、ツニカマイシン添加NCSU37培養液で成熟させて囲卵腔が小さくなった卵母細胞では有意に高く71.7%であった。以上の結果から、ブタ卵母細胞の囲卵腔の大きさと多精子侵入の頻度との間には密接な関係のあることが確認された。 Read more
5.

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新村, 末雄 ; 大樌, 香苗
Published: 新潟大学農学部研究報告 = 新潟大学農学部研究報告.  58  pp.39-43,  2005-08.  新潟大学農学部
Full Text Link: http://hdl.handle.net/10191/657
Abstract: 体外で成熟過程にあるブタの卵母細胞、1細胞期から拡張胚盤胞期までの体外受精に由来するブタの卵子と初期胚について、グルコース-6-リン酸脱水素酵素(G-6-PDH)の活性を組織化学的に検出した。G-6-PDH活性は、胞状卵胞から採取直後の卵母 細胞では強く、この強い活性は培養後44時間の卵母細胞まで維持された。また、この酵素の活性は、媒精後の受精卵子でも強かったが、2細胞期から16細胞期の胚ではやや弱まり、弱度ないし強度となった。桑実胚期以降、酵素活性はさらに弱まり、活性を示さない胚も出現するとともに、拡張胚盤胞では活性はまったくみられなかった。以上の結果と従来のステロイド代謝能の結果とを考え合わせると、成熟過程にあるブタの卵母細胞と発生過程にあるブタの初期胚は、G-6-PDHの作用によって産生したNADPHをステロイドの生合成のために利用していることが推察された。The activity of gucose-6-phosphate dehydrogenase (G-6-PDH) in porcine oocytes and embryos was histochemically examined by the Rudolph and Klein method. Strong activity of G-6-PDH was observed in oocytes cultured for maturation and in fertilized oocytes, and blue diformazan granules produced by the enzyme reaction were spread evenly throughout the cytoplasm. In embryos, the activity somewhat decreased at the 2-cell stage, and the such activity was maintained up to the 16-cell stage. The activity weakened in embryos at the morula and early blastocyst stages, and some of them showed no enzyme activity. The enzyme activity completely disappeared from expanded blastocysts. In cleaved embryos, diformazan granules were distributed throughout the cytoplasm of blastomeres, while the amount of the granules differed among blastomeres. In early blastocysts, the granules were distributed in the cytoplasm of inner-cell-mass cells, but not in the cytoplasm of trophoblasts. The results obtained from this investigation and former studies concerning steroid metabolism seem to suggest that porcine oocytes and preimplantation embryos utilize NADPH produced by G-6-PDH for biosynthesis of steroids. Read more
6.

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Takano, Hiroko ; Niimura, Sueo
Published: 新潟大学農学部研究報告 = 新潟大学農学部研究報告.  57  pp.15-20,  2004-08.  新潟大学農学部
Full Text Link: http://hdl.handle.net/10191/666
Abstract: Using the enzyme-linked immunosorbent assay and the method of reverse transcription-polymerase chain reaction, cAMP and adenylate cyclase mRNA were demonstrated in porcine oocytes with cumulus cells (COCs) and denuded oocytes (DOs) treated with olomoucine, an inhibitor of cyclin dependent kinase of maturation promoting factor, and the cAMP content and the ability to synthesize cAMP in the treated oocytes and cumulus cells were examined. The fluctuation of cAMP content and the ability to synthesize cAMP in porcine oocytes and cumulus cells cultured for various periods were also examined. The concentration of cAMP in olomoucine-treated COCs was 173 fM, which was significantly lower than 3,067 fM in non-treated COCs, whereas the concentration of cAMP in DOs treated with olomoucine (39 fM) was similar to that in non-treated DOs (24 fM). The concentration of cAMP in cultured DOs was always low and did not significantly change during maturation culture. The concentration of cAMP in cultured COCs was low until 8 hrs of culture, whereas that increased rapidly after 8 hrs of culture and reached the maximum at 12 hrs of culture. The concentration of cAMP in COCs decreased after 22 hrs of culture. The expression of adenylate cyclase mRNA was weaker in COCs and DOs treated with olomoucine than in control COCs and DOs. In cultured COCs and DOs, the expression of such the mRNA was always demonstrated and stronger in those cultured for 8 hrs than in those cultured for 0, 22, 32 and 44 hrs. From these results, it was suggested that cAMP contained in COCs is mostly derived from cumulus cells, although cAMP is synthesized in oocytes. The present findings also suggested that the olomoucine treatment inhibits cAMP synthesis in cumulus cells, which in turn results in the low cAMP level in the cytoplasm of oocytes.卵母細胞成熟促進因子の調節サブユニットであるサイクリンBキナーゼの活性化をオロモウシンで阻害したブタの卵丘卵母細胞複合体(COC)と裸化卵母細胞(DO)について、cAMPおよびcAMPの合成酵素であるアデニル酸シクラーゼのmRNAの検出をELISA法あるいはRT-PCR法を用いて行い、cAMPの含量と合成能に及ぼすオロモウシンの影響を検討した。併せて、各種時間培養したブタのCOCとDOについても、cAMPおよびアデニル酸シクラーゼmRNAの検出を行い、卵丘細胞と卵母細胞におけるcAMPの含量および合成能の変化を調べた。COCが含有するcAMPの濃度は、オロモウシンとともに22時間培養したものでは173fMであり、無処置のものの3,067fMに比べて有意に低かったが、 DOが含有するcAMPの濃度は、オロモウシン処置したもの(39 fM)と無処置のもの(24 fM)との間で相違なかった。またcAMPレベルは、DOでは常に低く、44時間までの培養の経過に伴う変化を示さなかったが、COCでは培養後12ないし22時間に著しく高くなった。一方、アデニル酸シクラーゼmRNAの発現はCOCとDOの両者で認められたが、その発現量は、COCとDOのいずれにおいても、培養後8時間で他の培養時間のものよりも多かった。また、オロモウシン処置したCOCとDOでは、アデニル酸シクラーゼmRNAの発現量は無処置のものに比べて少なかった。以上の結果から、卵母細胞と卵丘細胞の両者はcAMPの合成能を持っているが、COCが含有するcAMPのほとんどは卵丘細胞に由来することが考えられた。またオロモウシン処置は、卵丘細胞でのcAMP合成を抑制することによって、卵母細胞内のcAMPレベルを低下させることがうかがわれた。 Read more
7.

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Takano, Hiroko ; Niimura, Sueo
Published: 新潟大学農学部研究報告 = 新潟大学農学部研究報告.  56  pp.67-73,  2004-03.  新潟大学農学部
Full Text Link: http://hdl.handle.net/10191/25113
Abstract: The state of nuclear maturation was observed in porcine oocytes cultured with various steroids, in order to identify whi ch steroids have a role of meiosis inducing substance (MIS) in porcine oocytes. In the oocytes cultured for 22 hrs, the percentage of oocytes with germinal vesicles (GVs) was significantly higher in those cultured with progesterone or 17α-hydroxyprogesterone (56.8 and 57.1 %) than in control oocytes (14.8 %), whereas the percentages of GV stage-oocytes cultured with cholesterol, pregnenolone, 17α-hydroxypregnenolone, 20α-hydroxyprogesterone or estradiol-17β (10.7 to 40.0 %) were similar to those of each control oocyte (14.8 to 67.9 %). At 44 hrs after maturation culture with various steroids, the percentages of oocytcs with the M Ⅱ stage nuclei were 42.9 to 91.7 % , showing no significant differences from those of each control oocyte (51.6 to 89.3 %). The developmental rates to 2-cell embryos of oocytes matured in the medium containing steroids also did not differ from those of each control oocyte, even in the use of either steroid examined. From the present findings, it was suggested that pregnenolone, progesterone, 17α-hydroxypregnenolone, 17α-hydroxyprogesterone, 20α-hydroxyprogesterone, estradiol-17β and cholesterol have no roles as MIS for porcine oocytes.<br />卵核抱期のブタ卵母細胞を各種ステロイドを含む培養液で培養し、核の成熟状態を観察した。22時間培養したブタ卵母細胞において、卵核胞期のものの割合は、プロゲステロンあるいは17α-ヒドロキシプロゲステロンと共に培養したものでは56.8および57.1%であり、対照の卵母細胞の14.8%に比べて有意に高かったが、コレステロール、プレグネノロン、 17α-ヒドロキシプレグネノロン、20α-ヒドロキシプロゲステロンあるいはエストラジオール-17βを含む培養液で培養したものでは10.7ないし40.0%であり、いずれもそれぞれの対照の卵母細胞の割合(14.8ないし67.9%)と相違なかった。また、各種ステロイドを含む培養液で44時間培養した卵母細胞において、第二成熟分裂中期に達したものの割合は、42.9ないし91.7%であり、いずれもそれぞれの対照の卵母細胞の割合(51.6ないし89.3%)と相違なかった。さらに、各種ステロイドを含む培養液で44時間培養した卵母細胞を媒精して48時間培養したところ、63.6ないし79.1%が2細胞胚に発生し、 2細胞胚への発生率は、いずれもそれぞれの対照の卵母細胞の発生率(72.5ないし86.2%)と相違なかった。以上の結果から、コレステロール、プレグネノロン、 17α-ヒドロキシプレグネノロン、プロゲステロン、 17α-ヒドロキシプロゲステロン、 20α-ヒドロキシプロゲステロンおよびエストラジオール-17βは、いずれもブタ卵母細胞の成熟分裂を誘起・促進する作用を持っていないことが推察された。 Read more